基因表达量的研究方法

差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。简单介绍如下：

DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：
①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；
②在逆转录酶作用下，以Oligo dT12MN为锚定引物将mRNA反转录成cDNA；
③ 以cDNA为模板利用10一mer随机引物和锚定引物进行PCR扩增；
④ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，结合银染等显色方法获得平行材料间的差异cDNA片段，回收并再扩增差异片段；
⑤Northern blotting检测差异cDNA片段是否为阳性片段；
⑥克隆cDNA片段并测序；
⑦ 根据测序结果筛选cDNA文库或使用RACE技术获得cDNA片段侧翼序列，进而获得其全长cDNA基因。

GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决目前用来检测基因表达差异的方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤，反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时，通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列，而其5′端包含了随机ACP的通用序列。第三步: 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR，这时使dT-ACP2和随机ACP能各