基因表达量的研究方法
来源:百度知道 编辑:UC知道 时间:2024/09/12 17:38:55
原核生物和真核生物基因表达量的研究方法有区别吗?
差异基因表达的研究受到了广泛的关注,常用的技术有DD-PCR;GENE-FISHING;GENE CHIP等。简单介绍如下:
DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术,此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础,结合银染或放射性自显影等显色技术,能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下:
①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA;
②在逆转录酶作用下,以Oligo dT12MN为锚定引物将mRNA反转录成cDNA;
③ 以cDNA为模板利用10一mer随机引物和锚定引物进行PCR扩增;
④ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物,结合银染等显色方法获得平行材料间的差异cDNA片段,回收并再扩增差异片段;
⑤Northern blotting检测差异cDNA片段是否为阳性片段;
⑥克隆cDNA片段并测序;
⑦ 根据测序结果筛选cDNA文库或使用RACE技术获得cDNA片段侧翼序列,进而获得其全长cDNA基因。
GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决目前用来检测基因表达差异的方法所面临的问题,如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤,反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时,通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置,而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA,其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列,而其5′端包含了随机ACP的通用序列。第三步: 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR,这时使dT-ACP2和随机ACP能各