请教，关于KPn1高温灭活纯化和T4连接酶体系的生化问题

我来回答第二个问题。T4连接酶。使用的是10Xbuffer,10微升只需1ul buffer。
T-vector 加入50ng。插入片段：T-vector 摩尔比在1：1－3：1之间。插入片段要过量，避免产生空载。温度控制在16度以下。1kbp 长度只要在16度连接1h足够。这方面有专门的试剂盒，生工的T－vector挺好，我一直在用，上面自带说明书，很详细可以看一下。

自己回答：现在连接的体系应该是没什么问题，可能是双酶切的时候没有完全把位点切开，毕竟两种酶在共用buffer的情况下存在竞争，虽然之前做过交叉试验验证了可行性。目前的计划是分别单酶切后纯化，保证能切开。 我们采用的摩尔比是片段：载体=3：1，理论是可行的，T4 ligase的效率是可信的。总之，还要继续摸索吧